[摘要]目的

探討煙酰胺對中波紫外線(UVB) 致豚鼠皮膚色素沉著的抑制作用。方法以亞紅斑劑量 UVB照射豚鼠背部10天建立皮膚無急性損傷色素沉著動物模型后，外涂基質(zhì)和2.5%、5%、10%的煙酰胺4周，在此期間觀察膚色改變和測定皮膚L值。涂藥結(jié)束后取材，進行Masson - Fontana、冰凍切片Dopa染色和黑素細胞超微結(jié)構(gòu)觀察，觀察黑素細胞數(shù)量、形態(tài)和功能的改變。結(jié)果涂抹5%煙酰胺4周后，豚鼠皮膚變白，L值顯著下降，多巴陽性黑素細胞數(shù)及黑素含量指數(shù)較對照組明顯減少(R0.05) 。結(jié)論5% 煙酰胺對UVB誘導(dǎo)的色素沉著有明顯的抑制，它主要是通過抑制黑素細胞的增殖和黑素細胞內(nèi)黑素小體的合成而發(fā)揮作用。

[關(guān)鍵詞]煙酰胺:色素沉著:黑 素細胞

 

煙酰胺是近年來嘗試用于美白和防曬化妝品中的一種化學(xué)物質(zhì) [1，2] ，

但對其效果和作用機制了解甚少。在國內(nèi)，我們曾應(yīng)用原代培養(yǎng)的人皮黑素細胞，探討了煙酰胺抑制黑素合成的適宜濃度[3]，為進一步明確煙酰胺對皮膚色素沉著的抑制作用，本文以棕黃色豚鼠無急性損傷UVB致黑模型評價煙酰胺對皮膚色度的影響，并探討了可能的作用機制。

1材料與方法

1.1 實驗動物 體重(355土12)g， 健康成年雌性Hartley棕黃色豚鼠10只(上海銀根動物養(yǎng)殖場)。

1.2 受試物carpobol基質(zhì);將煙酰胺(分析純，中國醫(yī)藥上海試劑供應(yīng)站)溶于carpobol中分別配成2.5%，5%、10%三種濃度。

1.3

動物模型在豚 鼠背部選定4cmX4cm區(qū)域脫毛后用TL12Rs型UV-B燈管(Philips 公司)按照16. 5mJ/d劑量照射10天，輻照總量為165mJ。照射結(jié)束后將產(chǎn)生豚鼠背部皮膚分為4個相離區(qū)域，分別外涂carpobol基質(zhì)、2.5%、5%、10%煙酰胺，每日2次，共計4周。每周用Lab色度儀(CM508d，Minolta 公司)測定動物受試皮膚區(qū)域L值，涂藥結(jié)束后，以Powershot S45 數(shù)碼相機(Canon 公司)攝影，然后在涂藥部位取皮膚做組織學(xué)檢查。

1.4 肉眼觀察實驗期間，每日觀察豚鼠皮膚的不良反應(yīng)，如紅斑、鱗屑和色素沉著。

1.5 染色方法Masson- Fontana染色:按常規(guī)方法固定、脫水包埋、脫蠟后，入氫氧化銀氨溶液作用12~ 18h后分別經(jīng)0.2%氯化金水溶液、5%硫代硫酸鈉液處理數(shù)分鐘。結(jié)果:黑素顆粒呈黑色。冰凍切片Dopa染色:新鮮組織低溫恒冷切片于0.1%多巴染液中37°C孵育2h，水洗并淺染蘇木素、曙紅液。結(jié)果:活性黑素細胞呈棕黑色。

 

1.6 組織學(xué)觀察

1.6.1 多巴陽性細胞計數(shù) 在高倍顯微鏡下(日本Olympus公司)，以單盲法計數(shù)Dopa切片中每平方毫米表皮基底層所含活性黑素細胞數(shù)。

1.6.2 黑素含量指數(shù)(melanin content index， MCI) 使用IMS細胞圖

像分析系統(tǒng)(上海申騰信息技術(shù)有限公司)。選擇Masson-Fontana切片10處

表皮，測定黑素顆粒面積占該處表皮總面積的百分比均值。

1.6.3 電鏡觀察在電子顯微鏡下，觀察黑素細胞超微結(jié)構(gòu)變化。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件包處理數(shù)據(jù)，結(jié)果用(x士s)

表示。用單因素方差分析，組間兩兩比較采用St udent -Newman-Keuls法。

2結(jié)果Jlinchutoul .com..

2.1皮膚外觀觀察豚鼠背 部皮膚在按16. 5mI/d低劑量UVB重復(fù)照射10天期間，未見皮膚潮紅、紅斑或皮屑等皮膚急性損傷反應(yīng)，照射14~17天色素沉著達到高峰。涂抹受試物后，豚鼠皮膚均未出現(xiàn)刺激反應(yīng)。實驗結(jié)束時，各組皮膚均有不同程度的色素淡化，而5%濃度組皮膚色素淡化最為明顯。

 

2.2 皮膚色度L值改變Lab儀測定的色度L值是皮膚黑度的量化指標，L值越高說明皮膚越白。皮膚L值變化(OL=L 用藥后-L用藥前)隨時間改變，。用藥2周時，涂抹基質(zhì)的皮膚由于UVB的滯后致黑作用L值下降了4.32，而5%煙酰胺組皮膚L值無明顯降低，兩組具有統(tǒng)計學(xué)差異(R<0.05) ;用藥4周結(jié)束時，基質(zhì)皮膚L值下降了2.88，而相應(yīng)的5%煙酰胺組皮膚較用藥前L值上升了2.03 (R<0.01) ，10%煙酰胺組皮膚L值則上升了1.67 (R<0.001)。

2.3光鏡觀察見表1。多巴陽性細胞計數(shù)和黑素含量指數(shù)的結(jié)果表明:與基質(zhì)組比較，5%和10%煙酰胺可以減少表皮基底層黑素細胞數(shù)(R<0.05) ,同時可抑制黑素含量(R<0.05)。但與5%和10%煙酰胺對黑素細胞和黑素合成的抑制作用差異無顯著性。

 

2.4 電鏡觀察見圖3。基質(zhì)組皮膚黑素細胞細胞膜完整，胞漿內(nèi)充斥大量成熟II、IV 期黑素小體和少量1、II 期黑素小體，但細胞器較少; 2. 5%煙酰胺組，黑素小體數(shù)量略微減少:在5%煙酰胺組皮膚中，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細胞器豐富，II、 IV期黑素小體明顯減少，散在分布于胞漿中; 10%煙酰胺組黑素小體分布與5%煙酰胺組近似。

 

3討論.

煙酰胺與煙酸統(tǒng)稱為維生素P P (維生素B 3)，是輔酶1、II 的重要組

成部分，在生物氧化過程中起遞氫作用，促進生物氧化和組織新陳代謝[4]。研究表明煙酰胺具有抗炎活性，能促進紫外線等誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)，抑制UVB輻射的光致癌性，在臨床上早已被廣泛用于糙皮病、持久性隆起紅斑、痤瘡等皮膚病[5] 。近年煙酰胺的延緩皮膚衰老和美白功能也開始受到重視，國外已有在防曬劑中加入煙酰胺來達到防曬效果[1]。煙酰胺是在光線，空氣中性質(zhì)最穩(wěn)定的水溶性維生素，而且對皮膚刺激最小[5]。毒理實驗發(fā)現(xiàn)其小鼠經(jīng)口LD50為(2.5~3.5) g/kg, 大大超過臨床使用劑量，而“三致”實驗均為陰性，現(xiàn)已被美國FDA認作安全藥物[4] 。Franz做煙酰胺經(jīng)皮吸收研究發(fā)現(xiàn)其平均彌散百分數(shù)為11% [4]。以上優(yōu)點說.明煙酰胺外用有減少色素沉著可能，關(guān)鍵在于煙酰胺是否有減輕色素沉著的效果。

煙酰胺是在光線，空氣中性質(zhì)最穩(wěn)定的水溶性維生素，而且對皮膚刺激最

小[5]。毒理實驗發(fā)現(xiàn)其小鼠經(jīng)口LD50為(2.5~3.5) g/kg,大大超過臨床

使用劑量，而“三致”實驗均為陰性，現(xiàn)已被美國FDA認作安全藥物[4] 。

Franz做煙酰胺經(jīng)皮吸收研究發(fā)現(xiàn)其平均彌散百分數(shù)為11% [4] 。以上優(yōu)點說

明煙酰胺外用有減少色素沉著可能，關(guān)鍵在于煙酰胺是否有減輕色素沉著的效

果。

由于棕黃色豚鼠體內(nèi)黑素細胞、黑素小體在毛囊、表皮的分布類似于人體(尤其是亞洲人)中的分布，其致黑模型應(yīng)用最為廣泛[3, 6]。不過，現(xiàn)有的紫外線誘導(dǎo)色素沉著的動物模型在建模過程中，多以大于最小紅斑劑量(MED)的UVB在短期內(nèi)連續(xù)照射，皮膚紅斑、蛻皮等皮膚損傷難以避免[3，6]。人體的自然曬黑過程通常不伴肉眼可見的皮膚損傷，因此為更好地模擬人體致黑情況，本文采用小劑量多次重復(fù)UVB照射致黑動物模型，在照射過程中，豚鼠皮膚無潮紅、紅斑、脫屑等急性損傷。用藥期間，涂抹基質(zhì)的皮膚于用藥1周時，L值降至最低(圖2)，皮膚黑度達到最高峰，隨后L值逐漸回升，其余三個煙酰胺濃度組的L值變化也呈現(xiàn)相似的趨勢。用藥2周時，5%煙酰胺已開始抑制皮膚的色素沉著:用藥4周實驗結(jié)束時，涂抹5%煙酰胺與10%煙酰胺皮膚L值已經(jīng)大于用藥前L值，美白

效果十分明顯，只是這2個有效濃度引起的皮膚L值改變差異無顯著性。肉眼觀察和通過圖像分析法對Masson-Fontana染色切片黑素含量的測定分析結(jié)果與用藥后皮膚L值改變情況相符，從不同角度說明了煙酰胺具有較為肯定的美白效果。皮膚色素沉著程度主要決定于以下幾個因素: (1) 酪氨酸酶、多巴色素互變酶(TRP-2) 、二羥基吲哚羧酸氧化酶(TRP- 1)等活化調(diào)節(jié)黑素細胞內(nèi)黑素合

成: (2) 黑素細胞增殖: (3) 黑素小體向角質(zhì)形成細胞的轉(zhuǎn)運和降解: (4)角質(zhì)形成細胞的新陳代謝速度等。通常，美白劑都是通過影響上述-一個或多個因素發(fā)揮作用。

 

目前，學(xué)術(shù)界對于煙酰胺是否能抑制黑素細胞增殖存在爭議:日本學(xué)者T.HAKOZAKI等[1]認為煙酰胺對黑素細胞增殖沒有影響:帕它木等[7]以不同濃度煙酰胺處理人皮黑素細胞發(fā)現(xiàn)隨煙酰胺濃度增加、作用時間的延長，抑制黑素細胞的增殖作用明顯增強。但現(xiàn)有的關(guān)于煙酰胺美白機制的探討都局限在細胞水平，離體細胞畢競不能反映人體的全部特征，從細胞外推到人體，需要一個很重要的步驟一動物實驗。本次動物實驗對涂抹煙酰胺的皮膚組織活檢Dopa染色的結(jié)果顯示5%和10%煙酰胺均可明顯減少位于表皮基底層的、具有黑素合成功能的活性黑素細胞數(shù)。由于在紫外線輻射下，角質(zhì)形成細胞分泌的細胞因子對于黑素細胞的功能狀態(tài)影響較大，如Imokawa等[8]研究發(fā)現(xiàn)紫外輻射誘導(dǎo)表皮中IL-1增多，IL-1 可以促進角質(zhì)形成細胞中內(nèi)皮素的釋放，而內(nèi)皮素反過來又可促進黑素細的分裂增殖，所以，即使離體細胞結(jié)果與本次動物實驗結(jié)果有差異，考慮是由于角質(zhì)形成細胞和黑素細胞間的相互作用引起的。此外，有研究表明煙酰胺在體外和活體都可以抑制活性氧族(ROS)的形成[9]，也有研究表明由紫外線輻射誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS [10]，并促進表皮黑素細胞的黑素合成[11]，因此煙酰胺也可能通過抑制黑素細胞內(nèi)的黑素合成發(fā)揮作用。于是，本文在透射電鏡下觀察用藥4周皮膚組織超微結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)果表明與基質(zhì)組皮膚相比，外用5%煙酰胺的皮膚表皮黑素細胞中II、IV 期黑素小體明顯減少。因此考慮抑制黑素細胞也是煙酰胺的作用途徑之一。總之，外用煙酰胺對紫外線致黑的豚鼠皮膚有明顯的抑制色素沉著的作用，5%的煙酰胺為適宜添加濃度，它的美白效果主要是通過抑制黑素細胞的增殖和黑素細胞內(nèi)黑素小體的合成發(fā)揮作用。

 

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