雞蛋白提取液對體外培養干細胞蛋白的影響(生物科學論文)

搞要 摘要:發現一種提取液能促進體細胞向干細胞轉變將在再生醫學研究中 有重要的意義，下 面是小編搜集整理的一.篇探究雞蛋白提取液對體外培養千 細胞蛋白影響的論文范文，歡迎閱讀參考。有文獻報道動物的卵細胞提取液 能重新編程體細胞，包括豬的卵細胞1和非洲爪蟾的

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 發現一種提取液能促進體細胞向干細胞轉變將在再生醫學研究中有重要 的意義，下面是小編搜集整理的一篇探究雞蛋白提取液對體外培養千細胞蛋 白影響的論文范文，歡迎閱讀參考。 有文獻報道動物的卵細胞提取液能重新編程體細胞，包括豬的卵細胞[1 ]和非洲爪蟾的卵細胞

[2, 3]提取液都能使體細胞核重編程。在這個研究中, 我們用雞蛋白提取液作用于不同細胞，共培養3d后，收集細胞，送公司做干 細胞蛋白芯片檢測，現將研究報道如下。

1材料與方法 細胞來源 

4種細胞為我們實驗室經常培養的細胞，C57小鼠的骨髓間充質干細胞(C 57-BMSC) (自己制備),樹駒的臍帶間充質干細胞(TS-UC- MSC) (自己制備), 293T細胞(購上海科拉曼有限公司)和GFP慢病毒轉染成 功的293T細胞(293T-GFP) (自己轉染成功)

 雞卵清提取液的制備 取幾個雞卵，無菌分離卵清和卵黃，卵清按1 : 1加裂解液，充分攪勻, . 存放于- 20C。凍融3次后，離心，取上清，4C保存。裂解液配方: 50mmol/LNaCl, 5 mmol/LMgCl2, 100mmol/LHEPES, , 1mmol/L二硫蘇糖醇(DTT), /L苯甲基磺酰氟( PMSF)和蛋白酶抑制劑。由此得到的提取液為雞卵清提取液。獲得的提取液 用50%的終濃度與293T細胞共培養3d,然后用定量PCR的方法檢測細胞多能基 因0CT4和NANOG與對照(培養基培養)相比明顯升高，即為質控指標合格，可 用于下面的實驗。

 

干細胞蛋白芯片檢測步驟 

 

      每個芯片孔中加入100μ l的1×封閉液，室溫搖床上孵育30min, 避免產生氣泡;抽去封閉液，每個孔中添加100μ1樣品， 一個陣列一個樣 品;4C振蕩過夜孵育。使用ThermoSci entificWel lwashVersa芯片洗板機清 洗玻片，每孔加入70μ 1生物素標記抗體;室溫震蕩孵育1^ 2h, 清洗，每孔 加入70μ1的1500倍稀釋的熒光劑- 鏈霉親和素，用密封條貼住玻片，然后用鋁箔紙包住玻片避光室溫震蕩孵育 12h.清洗，采用激光掃描儀例如AxonGenePix掃描信號。采用芯片分析軟件 提取數據，對于Foldchange,選取大于為有統計學意義。

 

檢測多能標志

 

    蛋白0CT4和NANOG兔抗人0CT4多克隆抗體購自Immunoa- way公司，鼠抗人NANOG單克隆抗體購自Millipore公司，二抗均購自碧云天 生物技術有限公司。293T細胞在6孔板中，一孔加培養基，一孔加50%終 濃度 的雞蛋白提取液，共培養3d后，用碧云天的IP細胞裂解液提細胞蛋白，取50 μ l細胞蛋白液加10μ l6×的上樣緩沖液，100C 水浴5min,上樣20 μl,進行SDS- PAGE電泳，電泳結束后，100v電壓轉膜 1h,膜用5%脫脂奶粉的TBS封閉37°C1h , 將一抗1 : 250稀釋于2%脫脂奶粉的TBS中，37"C振搖1h, TTBS洗3次， 每次5m in,二抗1 : 200稀釋于2%脫脂奶粉的TBS中，37C振搖1h, TTBS洗3次，每次5m in, ECL顯色，用Tanon的化學發光成像儀檢測發光條帶。

 2結果 

      有3個蛋白發生了統計學意義的改變S0X17、BMPR- 1A和NANOG是干細胞中表達的蛋白，當體細胞向干細胞轉變后細胞中這幾個 蛋白的表達升高，我們用50%終濃度的雞蛋白提取液與C57-BMSC共培養3d后，這幾個蛋白的表達明顯升高，說明C57- BMSC又向更多能的干細胞分化了，見圖1.

有1個蛋白發生了統計學意義的改變BMPR- 1A是干細胞多能性的標志，TS-UC- MSC用50%雞蛋白提取液共培養3d后，與未加雞蛋白提取液培養的細胞相比， BMPR-1A明顯升高，說明細胞又向多能干細胞的方向分化了，見圖2. 有1個蛋白發生了統計學意義的改變BMPR- 1A是干細胞多能性的標志，293T細 胞是標準的體細胞株，用50%雞蛋白提取 液共培養3d后，BMPR- 1A表達明顯升高，說明293T細胞有向干細胞轉變的現象發生，

見圖3.

 有1個蛋白發生了統計學意義的改變0CT4是千細胞多能性的標志，293T- GFP用50%的雞蛋白提取液共培養后，對比培養基培養的細胞0CT4的表達明顯 增加，說明細胞有向干細胞轉化的現象。 細胞0CT4和NANOG蛋白的Westernblot結果(圖5)0CT4和NANOG蛋白是干細 胞多能性的標志，293T細胞用50%的雞蛋白提取液共培養后，0CT4和NANOG蛋 白的表達量明顯增加(圖5和表1),與對照組(培養基培養)相比有統計學意義( P<, n=3)

3討論

 S0X17、BMPR- 1A、NAN0G和0CT4是 千細胞中表達的蛋白，在細胞轉化為多能的干細胞時， 這幾個蛋白的表達明顯升高。因此，這些蛋白在細胞中表達明顯升高時，可 以認為細胞向多能的干細胞發生了轉化。我們用共培養法發現加了50%雞蛋 白提取液的細胞有- -些千細胞蛋白表達明顯升高， O無識別結果胞提取液誘 導體細胞核重編程的方法，通常用可逆滲透法，即先用鏈球菌溶血素0(SL0)在細胞膜上打孔，再用卵細胞提取液滲透，最后再用氯化鈣再封合細胞膜上 的孔，是否這種方法誘導效率更高，需要今后的實驗進- - -步深入研究。

 

我們在實驗中用了4種細胞，C57 小鼠的骨髓間充質干細胞(C57- BMSC)、樹駒的臍帶間充質干細胞(TS-UC- MSC)、293T細 胞(購自中國科學院昆明細胞庫)和GFP慢病毒轉染成功的293T 細胞(293T- GFP),用50%的雞蛋白提取液共培養3d后，均檢測到了干細胞相關蛋白表達的 升高，說明了雞蛋白提取液有誘導細胞向多能干細胞轉變的現象，因為多能 標志蛋白有意義地升高了。

 對比豬卵提取液和蟾蜍卵提取液，雞蛋白提取液獲取更方便，獲取量更 大，提取過程注意無菌操作，獲得的雞蛋白提取液無須過濾除菌就可用于細 胞培養，有較大的應用價值。在我們以前的研究中，發現雞蛋白提取液有促 細胞增殖的作用[4, 5],還有促進多能因子0CT4和NANOG升高表達的作用[6, 7] ,因此在本研究中我們進- - 步應用干細胞蛋白芯片檢測更多的多能因子，同 時使用4種細胞，都檢測到其中多能因子的升高表達，C57- BMSC有S0X17、BMPR- -1A和NANOG這3個蛋白發生了統計學意義的改變，TS-UC- MSC有BMPR- -1A蛋白發生了統計學意義的改變，293T有BMPR- 1A蛋白發生了統計學意義的改變，293T- GFP有0CT4蛋白發生了統計學意義的改變，進一步驗證了雞蛋白提取液有誘 導體細胞向多能細胞轉變的作用。

 

由于C57-BMSC和TS-UC- MSC是間充質干細胞，它們經過誘導后多能因子進- -步升高表達，是否證明 了雞蛋白提取液含有某些逆向分化細胞的特殊物質，以及這些物質的鑒定和 分離提取還有待實驗進一步驗證。

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