L-絲氨酸的酶法合成及分析

L-絲氨酸的酶法合成及分析

摘要:利用重組大腸桿菌表達(dá)絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT) 和 色氨酸酶(TPase)， 并利用雙酶法合成L-色氨酸。采用PCR 從大腸桿菌K12基因組中擴(kuò)增上述兩種酶的基因，利用pET- 28a載體，構(gòu)建單表達(dá)重組質(zhì)粒pET-SHMT、 pET-TPase 和共 表達(dá)重組質(zhì)粒pET-ST。 將上述3種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21 (DE3)進(jìn)行表達(dá)。SDS-PAGE 結(jié)果表明，單表達(dá)基因工程菌 BL21 (DE3) /pET-SHMT和BL21 (DE3) /pET-TPase分別在47 kDa (SHMT)和50 kDa (TPase) 處有蛋白表達(dá)帶;共表達(dá)基因工程 菌BL21 (DE3)/pET-ST在上述兩處均有蛋白表達(dá)帶。與宿主菌 相比，單表達(dá)SHNT基因工程菌產(chǎn)酶活性提高了6.4 倍;單表. 達(dá)TPase基因工程菌產(chǎn)酶活性提高了8.4 倍;共表達(dá)SHMT 和TPase 基因工程菌產(chǎn)酶活性分別提高了6.1和6.9倍。利用工程菌所產(chǎn)酶進(jìn)行雙菌雙酶法和單菌雙酶法合成L-色氨酸。 兩菌雙酶合成L-色氨酸的累積量達(dá)到41.5 g/L，甘氨酸轉(zhuǎn)化 率為83.3%，吲哚轉(zhuǎn)化率為92. 5%;單菌雙酶合成L-色氨酸. 的累積量達(dá)到28.9 g/L，甘氨酸轉(zhuǎn)化率為82. 7%，吲哚轉(zhuǎn)化 率為82. 9%。 關(guān)鍵詞:絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶，色氨酸酶，串聯(lián)表達(dá)，雙酶法 合成

物性性質(zhì)

 1.性狀:有左旋體和消旋體兩種，左旋體是白色六角棱柱狀晶 體，味甜;消旋體是白色單斜棱柱狀晶體。

 2.密度(g/mL, 25/4C) : 1.415

 3.相對(duì)蒸汽密度(g/mL, 空氣=1) :未確定

 4.熔點(diǎn)(°C) : 223~228C (分解) 

5.溶解性:左旋體，溶于水，不溶于無(wú)水乙醇和乙醚;消旋體。 略溶于水，不溶于無(wú)色乙醇、乙醚。

.主要用途 1.作生化試劑和食品添加劑。 

2.營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑，在化妝品中作為皮膚營(yíng)養(yǎng)添加劑。

 3.可供生物化學(xué)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究之用，也可作為合成環(huán)絲氨酸的 原料。 原理 本項(xiàng)目主要研究絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶催化甘氨酸生成L-絲氨酸。 絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT) 在生物體內(nèi)是由GlyA基因編碼 的，此酶能在四氫葉酸(THF)、甲醛及磷酸吡哆醛5' -PLP存 在下，催化甘氨酸生成L-絲氨酸。其反應(yīng)過程右圖所示。

材料、試劑、儀器: 1、原料:細(xì)菌破碎上清液 2、主要試劑

甘氨酸、甲醛、四氫葉酸、氯化鈉、葡萄糖、無(wú)水乙醇、氯化 鈣、氫氧化鈉 

3、主要儀器 電子天平，無(wú)菌超凈工作臺(tái)高速離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱 方法.

 1、甘氨酸濃度確定:在5個(gè)250ml三角瓶中分別加入上面收集 的上清酶液100ml，加入甘氨酸至終濃度分別為6 mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、 12mmol/L 和14mmol/L,再加入 甲醛至終濃度10 mmol/L， 磷酸吡哆醛至終濃度0.5mmol/L，四 氫葉酸至終濃度5 mmol/L， 37°C，190rpm 搖床反應(yīng)16h。反應(yīng) 液進(jìn)行L-絲氨酸濃度測(cè)定。.

 

2、甲醛濃度確定:在5個(gè)250ml三角瓶中分別加入上面收集的 上清酶液100ml，加入甲醛至終濃度分別為0 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、 15 mmol/L 和20mmol/L,再加入甘氨酸至 終濃10mmol/L，磷酸吡哆醛至終濃度0. 5mmol/L，四氫葉酸至. 終濃度5 mmol/L, 37C，190rpm 搖床反應(yīng)16h。反應(yīng)液進(jìn)行L- 絲氨酸濃度測(cè)定。

 3、磷酸吡哆醛濃度確定:在5個(gè)250ml三角瓶中分別加入上面 收集的上清酶液100ml，加入磷酸吡哆醛至終濃度分別為0 mmol/L、0.2 mmol/L、 0.5 mmol/L、0. 75 mmol/L 和1mmol/L,

再加入甘氨酸至終濃度10 mmol/L， 甲醛至終濃度10mmol/L, 四氫葉酸至終濃度5 mmol/L， 37C，190rpm 搖床反應(yīng)16h。反. 應(yīng)液進(jìn)行L-絲氨酸濃度測(cè)定。 

4、pH確定:在5個(gè)250ml三角瓶中分別加入上面收集的上清 酶液100ml,加入甘氨酸至終濃度為10 mmol/L， 再加入甲醛至 終濃度10 mmol/L, 磷酸吡哆醛至終濃度0.5mmol/L，四氫葉酸 至終濃度5 mmol/L，并調(diào)節(jié)不同的pH為 6.0,7.0,8. 0,9.0, 10.0，37°C，190rpm 搖床反應(yīng)16h。反應(yīng)液 進(jìn)行L-絲氨酸濃度測(cè)定。

5、 反應(yīng)時(shí)間確定

      :在5個(gè)250ml三角瓶中分別加入上面收集 的上清酶液100ml，加入甘氨酸至終濃度為10 mmol/L， 再加入 甲醛至終濃度10 mmol/L， 磷酸吡哆醛至終濃度0. 5mmol/L，四 氫葉酸至終濃度5 mmol/L, 37°C，190rpm 搖床反應(yīng)時(shí)間分別為 Oh, 8h, 16h, 24h, 36h。反應(yīng)液進(jìn)行L-絲氨酸濃度測(cè)定。絲氨酸 的分離與分析檢測(cè)

絲氨酸的分離與分析檢測(cè)原理

 

     薄層層析是一種微量而快速的層離方法。這種層析方法是把吸 附劑如氧化鋁或硅藻土涂布于薄板上(玻璃或金屬等)形成薄 層，把要分析的樣品溶液滴加到薄層的- -端，然后在此薄層上 用適當(dāng)?shù)娜軇┻M(jìn)行展開即為薄層層析。本實(shí)驗(yàn)中硅膠作為一種 固相支持物，它與水有較強(qiáng)的親和力而與有機(jī)溶劑親和力較弱。層析時(shí)吸著在硅膠上的水是固定相，而展層溶劑是流動(dòng)相。當(dāng) 欲被分離的各種物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中的分配系數(shù)不同時(shí), 它們就能被分離開。

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